文|編輯唐文筆飛揚|唐文筆飛揚

GO和r-GO作為二維納米材料，具有獨特的化學(xué)和物理特性，使其在生物醫(yī)學(xué)、電子元器件、儲能等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用潛力。

但隨著其應(yīng)用范圍的擴(kuò)大，人們對其潛在的毒性作用產(chǎn)生了懷疑。 因此，全面的體外藥理評價是保證GO和r-GO安全應(yīng)用的關(guān)鍵。

石墨烯基納米材料（GO 和 rGO）的細(xì)胞毒性評估

GO 和 r-GO 的細(xì)胞毒性最初是使用改良的乳酸酯酶 (LDH) 測定法進(jìn)行評估的，該測定法基于細(xì)胞內(nèi) LDH 水平的量化而非 LDH 釋放。

LDH 的釋放可以揭示細(xì)胞膜的損傷，這是壞死的跡象，而改良的 LDH (m-LDH) 檢測僅提供樣品中活細(xì)胞數(shù)量的信息，不能作為壞死的指標(biāo)。

然而，這些變化允許在分析之前去除多余的納米顆粒，從而降低干擾碳基納米材料的風(fēng)險。

因此，m-LDH 測定被認(rèn)為是迄今為止評估此類材料細(xì)胞毒性的最可靠方法。 GO和r-GO的評價結(jié)果??表明，毒性與時間和含量有關(guān)，與細(xì)胞類型和數(shù)學(xué)物理有關(guān)。 功能相關(guān)。

更短的暴露時間（3 小時）不會對材料或細(xì)胞類型造成明顯的毒性，但是，從 24 小時開始，可以觀察到材料之間的差異。

對于MRC-5細(xì)胞，細(xì)胞存活率隨著時間的推移和GO含量的降低而增加，最高含量條件下的細(xì)胞存活率分別為12.9±35%和5.2±27%。

細(xì)胞暴露于 GO 含量高達(dá) 1/ml 24 小時導(dǎo)致所有處理具有相似的功效（大約 70-60% 的細(xì)胞活力）。

但48小時后，不僅是最低的兩個水平，其他水平的細(xì)胞活力均低于LD50。

相比之下，暴露于 r-GO 不會顯著影響細(xì)胞活力，其在所有處理和時間點都保持在 80% 的毒性閾值附近。

對于 A549 細(xì)胞，GO 和 r-GO 顯示出非常相似的細(xì)胞毒性特征，并且對于這兩種材料，細(xì)胞毒性隨著含量和時間的減少而逐漸降低。

雖然r-GO的毒性與MRC-5的結(jié)果幾乎一致，但與健康細(xì)胞相比，GO對癌細(xì)胞的作用較弱。

事實上，24 和 48 小時后，A549 細(xì)胞在 1/ml 時的存活率是 MRC-5 細(xì)胞的兩倍。

最常用的細(xì)胞毒性測定有一些局限性，因此尋求替代方法來確認(rèn)細(xì)胞毒性數(shù)據(jù)。

在用于研究細(xì)胞存活的所有測量中，基于發(fā)光的分析是唯一沒有報告對碳基材料產(chǎn)生干擾的分析。

然而，關(guān)于金屬納米粒子干擾的報告表明，使用這些檢測方法可能存在問題，干擾光并不是唯一需要考慮的原因。

事實上，由于碳基材料與非胺甲唑藍(lán)晶體的相互作用，MTT 等代謝檢測可能會導(dǎo)致假陽性（廣譜）結(jié)果。

考慮到所有這些激勵措施，研究了一種新的發(fā)光測定模式 - MT - 以評估其對石墨烯納米材料研究的適用性。

這些特定的細(xì)胞存活測定測量活細(xì)胞的還原潛力，因此不允許消除納米材料，使該測定非常適合干擾研究。

在這種測定形式中，信號是通過將還原的 MT 底物從細(xì)胞擴(kuò)散到周圍介質(zhì)中產(chǎn)生的，底物與熒光素酶結(jié)合，產(chǎn)生的發(fā)光信號與活細(xì)胞的數(shù)量相關(guān)。

在最初的實驗中，只使用了 GO，因為它比 r-GO 具有更好的分散性。

盡管考慮了終點、敏感性和毒性機(jī)制的差異，但暴露 3 小時后獲得的細(xì)胞存活結(jié)果已經(jīng)表明可能存在干擾，因為這些較短的暴露時間與 GO 的明顯毒性無關(guān)。

相反，-MT 細(xì)胞存活結(jié)果顯示，盡管暴露于低水平的 GO (31.25ug/ml)，但細(xì)胞存活率增加了 50%。

值得注意的是，在使用改良的 LDH 測定法評估細(xì)胞毒性時，沒有觀察到這些毒性水平，盡管在更高的水平和 48 小時的處理時間。

眾所周知，基于代謝的測定可能會低估物質(zhì)對細(xì)胞代謝的影響而不影響細(xì)胞活力，因為此類測定將代謝活動描述為細(xì)胞活力的間接指標(biāo)。

然而，與預(yù)期高的 m-LDH 分析數(shù)據(jù)相比，-MT 分析觀察到的 GO 對 A549 細(xì)胞的顯著細(xì)胞毒性在 31.25 至 125 ug/ml 范圍內(nèi)的所有時間點均超過了-MT 分析靈敏度。

為了闡明與 m-LDH 測定數(shù)據(jù)的差異，進(jìn)行了另一項實驗，其中將細(xì)胞與測定試劑一起孵育，并在 24 小時后測量熒光硬度。

確定基線后，向孔中加入不同含量的GO，立即檢測熒光硬度。 結(jié)果表明，加入GO后熒光硬度顯著降低。 當(dāng)含量為15.6和/ml時，平均信號分別降低。 25% 和 95%。

綜合所有這些結(jié)果，可以推斷 GO 會干擾基于熒光的測定。 雖然沒有報道，但這在某種程度上是意料之中的。 由于碳納米材料會干擾熒光，因此這是一個密切的相關(guān)性。 現(xiàn)象。

據(jù)報道，GO 與測定中的試劑之間的相互作用不可忽略，很可能需要修改熒光測定，引入額外的步驟來消除納米顆粒，類似于 LDH 測定所需的步驟。

石墨烯納米材料的細(xì)胞相互作用

在確定了石墨烯衍生物在肺細(xì)胞中可能產(chǎn)生的細(xì)胞毒性作用后，我們詢問細(xì)胞毒性是由于內(nèi)吞作用還是與質(zhì)膜相互作用。

一些研究表明，石墨烯納米顆粒的摻入是其觀察到的細(xì)胞毒性的原因，而另一些研究表明，石墨烯摻入細(xì)胞可以提供治療性抗生素而不會對細(xì)胞造成損害。

納米粒子進(jìn)入細(xì)胞需要不同的能量依賴性內(nèi)吞過程。 內(nèi)吞途徑有多種類型，包括吞噬作用，它可以主動將大顆粒（>）內(nèi)吞到吞噬細(xì)胞中。

據(jù)報道，內(nèi)吞作用根據(jù)納米粒子的大小分為多種機(jī)制，即微吞噬作用（

非吞噬細(xì)胞如 A549 和 MRC-5 也可以攝取小顆粒。 研究中石墨烯衍生物的平均粒徑主要大于。 預(yù)計它們在 MRC-5 和 A549 細(xì)胞中的內(nèi)吞作用將通過細(xì)胞內(nèi)吞咽機(jī)制進(jìn)行。

一些納米粒子有可能通過質(zhì)膜被動擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞，例如，據(jù)報道碳納米管通過穿透質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞。

熒光染色通常用于研究納米粒子如何被細(xì)胞吸收，然而，信號淬滅使這些方法不適用于石墨烯納米材料。

Al-He 提出了一種替代方法，該方法基于流式細(xì)胞術(shù)對光散射變化的定性評估。

具體來說，這種方法基于碳基納米材料與細(xì)胞的結(jié)合，導(dǎo)致粒徑減小，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為側(cè)向散射分布的變化。

側(cè)向散射模態(tài)已成功用于研究碳納米管、氧化鋅、二硅氧烷和銀納米粒子的攝取，雖然難以區(qū)分納米粒子的細(xì)胞吸附和細(xì)胞內(nèi)吞，但有望進(jìn)一步改進(jìn)。 提供有關(guān)石墨烯納米材料與細(xì)胞相互作用的有用信息。

在本實驗中，細(xì)胞暴露于 /ml 的最高濃度，由于石墨烯衍生物在較高濃度下表現(xiàn)出的高細(xì)胞毒性，細(xì)胞計數(shù)可能較低。

實驗已知，側(cè)向散射分布沒有變化表明納米材料與 MRC-5 和 A549 細(xì)胞之間的相互作用可以忽略不計。

這在一定程度上挑戰(zhàn)了細(xì)胞毒性數(shù)據(jù)，特別是在 MRC-5 細(xì)胞的情況下，在 /ml 的 GO 處理 48 小時后觀察到的低細(xì)胞活力表明細(xì)胞和納米材料之間存在某種關(guān)系。 相互作用。

GO 和 r-GO 細(xì)胞毒性的機(jī)制評估

細(xì)胞暴露于細(xì)胞毒性物質(zhì)會導(dǎo)致不同類型的細(xì)胞死亡，其中一個例子是被稱為壞死的無意細(xì)胞死亡。

壞死過程表現(xiàn)為快速的細(xì)胞疼痛和膜完整性的喪失，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)釋放到周圍環(huán)境中。

壞死性細(xì)胞死亡不是細(xì)胞死亡的唯一形式，細(xì)胞也可能經(jīng)歷自噬，這是一種高度調(diào)節(jié)的細(xì)胞自殺過程。

自噬的標(biāo)志包括細(xì)胞質(zhì)收縮、細(xì)胞膜破裂、細(xì)胞核凝縮和明確無誤的破裂。 除了自噬和壞死，端粒是細(xì)胞死亡的另一種機(jī)制。

端粒是一種循環(huán)系統(tǒng)，可以分解異常的蛋白質(zhì)團(tuán)塊、細(xì)胞質(zhì)成分和受損的細(xì)胞器，然而，不受限制的細(xì)胞凋亡可能導(dǎo)致非自噬性細(xì)胞死亡。

據(jù)報道，端粒功能的破壞會導(dǎo)致細(xì)胞損傷并導(dǎo)致細(xì)胞死亡，這被認(rèn)為是納米材料毒性的潛在機(jī)制之一。

納米顆粒毒性的機(jī)制已得到廣泛研究，據(jù)報道，不同類型的納米材料可以通過在許多生物系統(tǒng)中形成活性氧 (ROS) 來誘導(dǎo)毒性。

ROS 的過量形成會導(dǎo)致氧化應(yīng)激，這種情況會導(dǎo)致不受控制的細(xì)胞信號傳導(dǎo)、細(xì)胞運動的變化、遺傳毒性、致癌作用、自噬和自噬，以及不同的毒性終點。

推理：

對于 GO，與細(xì)胞的化學(xué)相互作用實際上比 r-GO 更明顯，這反映在對兩種細(xì)胞系的細(xì)胞信號蛋白的明顯影響上。

納米顆?？梢耘c細(xì)胞膜受體相互作用，從而調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。 因此，GO納米片與細(xì)胞膜受體的結(jié)合可能會引起信號干擾。

GO 易位到細(xì)胞中可能是觀察到的細(xì)胞紊亂的觸發(fā)因素，但需要進(jìn)一步的工作來否認(rèn)這一點。

提出GO的形狀（像條狀結(jié)構(gòu)）可能會阻塞A549細(xì)胞表面的通道，從而干擾物質(zhì)交換。

該研究還表明，GO進(jìn)入A549細(xì)胞的能力較差。 因此，細(xì)胞膜對物質(zhì)交換的阻斷可能是GO的間接作用，導(dǎo)致不同細(xì)胞信號通路失調(diào)。

關(guān)于 GO 納米片的間接作用的另一種可能性是它們從培養(yǎng)基中吸收營養(yǎng)，引起氧化應(yīng)激和細(xì)胞饑餓，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這是許多研究人員報道的一種現(xiàn)象。

總之，GO 而不是 r-GO 可以誘導(dǎo)肺細(xì)胞系中細(xì)胞信號通路的失調(diào)，這些能力可能具有臨床意義，也可能闡明與 GO 藥理作用相關(guān)的機(jī)制。

參考：

1. 石墨烯對動物生理毒性作用的研究進(jìn)展。 翁以能； 江楠； 李嘉欣； 應(yīng)志寧； 杜少霆。 應(yīng)用生態(tài)學(xué)雜志, 2020

2. 石墨烯材料與蛋白質(zhì)的相互作用。 王小娟； 劉真真； 陳琪; 王小強(qiáng)； 黃芳。 物理學(xué)進(jìn)展, 2019

3、氧化石墨烯在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。 杜夏夏； 舒剛; 陳宗彥。 功能材料, 2018

4. 石墨烯的制備、功能化及應(yīng)用。 宗魯彥； 常旭; 吳慧霞； 楊世平。 南京師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2016

5. 石墨烯和氧化石墨烯對細(xì)胞脂質(zhì)膜損傷作用的研究。 屠宇松； 方海平。 中國科學(xué)：數(shù)學(xué)，熱天文學(xué)，2016